En 1969, Tomlin entró en el show de sketches Laugh-In. Algunos personajes del show han quedado asociados con ella a lo largo de su carrera:
Tomlin también fue una de las primeras comediantes que rompió con el estereotipo del drag masculino. Aunque los hombres hacían drag en Hollywood desde hacía mucho tiempo, Tomlin abrió nuevas fronteras no solo al cruzar los estereotipos de género, sino también de raza. Trabajó a fines de los años setenta con Pervis Hawkins, un cantante negro de soul y rhythm-and-blues, con bigote y barba, y un peinado afro, vestida con un traje de tres piezas. Como parte del personaje, usaba un poco de cosmético para oscurecer la piel (que dependía de la cantidad de luz en el escenario).
AT&T le ofreció a Tomlin 500.000 dólares para presentar su personaje Ernestine en un comercial de televisión pero ella se negó aduciendo que ello comprometería su integridad artística. En 1976 apareció como Ernestine en una parodia de comercial en Saturday Night Live, en el cual gritaba: «No nos importa, no, nosotros no tenemos que... Somos la companía de teléfonos. El 11 de enero de 1994, el personaje hizo una aparición en The Superhighway Summit en la Universidad de California en Los Ángeles, interrumpiendo una conferencia acerca de la super autopista de la información que estaba dando el entonces vicepresidente Al Gore. En 2003, hizo dos comerciales como Ernestine para WebEx.
En 1973 tuvo su primer programa especial titulado Lily, en el cual hizo el guion. A este le siguieron otros dos: Lily (1974) y The Lily Tomlin Special (1975), asimismo con guiones suyos.
Tomlin es famosa por su versatilidad. En la película Nashville (de Robert Altman), hizo de Linnea Reese, por la cual estuvo nominada al Oscar en la categoría de mejor actriz secundaria. Se trataba de una cantante de góspel, madre de dos hijos sordos, que tiene un amorío con un cantante de música country interpretado por Keith Carradine.
Posteriormente coprotagonizó junto a Dolly Parton y Jane Fonda la comedia Cómo eliminar a su jefe Nine to Five. (1980).
Hizo varios personajes cómicos en la película La increíble mujer menguante (1981), e interpretó a la enfermiza heredera en la comedia All of Me, de Steve Martin.
Ella y Bette Midler hicieron de unas gemelas que fueron separadas al nacer en la comedia Big Business (1989), filmada en el Hotel Plaza de Nueva York.
Le puso la voz al personaje de Frizzle en la serie animada The Magic School Bus de 1994 a 1998. También en la década de los 90 realizó reiteradas apariciones en la sitcom
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